در موارد حاد و فوق حاد بیماری ، تشخیص اولیه با مشاهده و دقت در علایم بالینی و آثار کالبد گشایی امکان پذیراست. اما در اشکال خفیف نمی توان با تکیه بر این عوامل به وجود بیماری پی برد و تشخیص قطعی بیماری نیازمند تشخیص آزمایشگاهی می باشد. تشخیص آزمایشگاهی با جداسازی ویروس و سپس انجام آزمایش های سرم شناسی صورت می گیرد. مهم ترین محل جهت جداسازی ویروس ، نای و کلوآک پرنده می باشد. البته در موارد آنفلوآنزای فوق حاد طیور به علت ویرمی شدید ، جداسازی ویروس از هر بافت و اندامی امکان پذیر است. ابتدا بافت های حاصله له شده ، به صورت تعلیق ) Suspension) 10 درصد در آمده سپس سانتریفوژ با دور پایین جهت جداسازی رسوبات صورت می گیرد. معمول ترین محیط جهت جداسازی ویروس ، تخم مرغ جنین دار 11 تا 11 روزه می باشد. روش کار بدین 1 سانتی متر مکعب نمونه را در حفره آلانتوییک ) جهت اطمینان هم در حفره / 1 تا 2 / صورت است که 1 آلانتوییک و هم در حفره آمنیوتیک ( تزریق کرده در دمای 37 تا 35 درجه سانتی گراد به مدت 3 تا 1 روزقرار می دهیم. پس از برداشتن تخم مرغ ها از انکوباتور ، آنها را در دمای 1 درجه سانتی گراد به مدت 6 تا 12 ساعت قرار می دهیم. مایع آلانتوییک ، 18 تا 52 ساعت پس از مرگ جنین ها برداشت می شود. توسط آزمایش های سرم شناسی زیر حضور ویروس آنفلوآنزای طیور تأیید می شود. 1 آزمایش الایزا ) - ELISA ) 2 آزمایش ایمونودیفیوژن ژل آگارز ) - AGID ) 3 آزمایش ممانعت از ماگلوتیناسیون ) - HI )1 آزمایش ایمونوفلورسانس ) - IF ) 7 روش - RT-PCR